实验室新引进小鼠，如何鉴定小鼠的基因型？常用的小鼠基因型鉴定方法有常规PCR鉴定，qPCR鉴定及测序。下面一起来详细聊聊吧~

 

除了实验室新引入小鼠外，还有以下几种情况需要进行基因型鉴定：

 

1、繁殖配对前：在进行小鼠繁育时，对繁育对进行基因型鉴定可以保证亲本的基因型准确无误。这样可以有效避免因亲本基因型错误而导致子代基因型混乱，从而提高繁育效率和实验结果的可靠性。

 

2、子代小鼠：如果亲本产生的后代有多种基因型（例如杂合子配杂合子），就需要对子代小鼠进行基因型鉴定。通过鉴定，可以筛选出符合实验要求的特定基因型小鼠，确保实验的顺利进行。

 

01、常用鉴定方法

 

1）常规PCR鉴定

 

目前最常用的基因型鉴定方法。通过设计特异性引物，利用PCR技术扩增目标基因片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的条带差异来判断小鼠的基因型。

 

特点：常用于肿瘤学、免疫学及炎症研究。操作简便、成本较低，适用于大多数实验室。

 

2）qPCR鉴定

 

qPCR（实时荧光定量PCR）是一种更为精确的基因型鉴定方法。它通过荧光信号实时监测PCR扩增过程，不仅可以判断基因型，还可以定量分析基因表达水平。

 

特点：灵敏度高、特异性强，但对设备和技术要求较高。

 

3）测序

 

对于一些复杂的基因型鉴定，如点突变小鼠，测序是必不可少的手段。通过测序可以直接读取目标基因的碱基序列，从而准确判断基因型。

 

特点：测序成本较高，但其结果最为准确可靠。

 

02、PCR鉴定操作步骤

 

一. 样本采集：

 

常用的样本来源包括小鼠的尾尖、耳廓、脚趾等组织。
 

一般建议在小鼠出生后9-14天进行采样。采样后，样本可置于-20°C冰箱保存备用。

 

二. 提取DNA模板：

2.1 试剂
 

a、鼠尾裂解液

 

图源清华大学实验动物中心

 

b、 蛋白酶K溶液
 

蛋白酶K（简称PK, 20mg/ml in MilliQ)，stored @-20℃

 

c、TE Buffer

图源清华大学实验动物中心

 

2.2 实验流程
 

1) 每个样品加入300ul裂解液+5ul PK（20mg/ml），55°C消化过夜（不少于4h）。
 

2) 乙醇沉淀：加入600ul（双倍体积）-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒，直到可以清楚的看见絮状沉淀。
 

3) 离心12000rpm，5min。
 

4) 晾干：离心后，倒出上层液体。倒放在一张平板纸上（注意一定要立着，这样里面的液体采用较快的流到EP管口）。差不多5-10min左右，把立着的管子换一个位置，轻轻向下按一下（目的是用平板纸吸去聚集在管口的液体，此步可以节省很多晾干时间）。等待30-60min至完全晾干，此时沉淀变透明，提取的DNA质量佳。
 

5) 加入200ul MilliQ水或TE溶液，使用上下振摇的方式充分溶解DNA。
 

6) 取3ul gDNA模板，在25ul的反应体系中进行PCR。

 

三. PCR：
 

3.1 反应体系（25ul体系）
 

 

图源清华大学实验动物中心

 

3.2 反应条件（touchdown）
 

 

图源清华大学实验动物中心

 

四. 电泳

 

4.1 配置凝胶：根据目标条带配置1-3%的琼脂糖凝胶，将1g-3g琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液，微波炉加热至琼脂糖融化，加入10ul核酸染料（EB替代物），倒入电泳模板中，并插入梳子，待冷凝后使用。

 

4.2 加样：向琼脂糖凝胶中加入适量的DNA，小孔建议加10ul，大孔建议加20ul，并根据目标条带大小选择合适DNA marker加入凝胶中。

 

4.3 跑胶：电泳仪设置120V电压，跑20-30min。

 

4.4 成像：使用凝胶成像系统观察、拍摄照片。

 

4.5 编辑胶图，出基因型鉴定结果报告。

 

03、注意事项

 

1）对照设置：在基因型鉴定实验中，设置合适的对照组非常重要。通常需要设置以下几种对照：

 

野生型对照：用于判断基因型及PCR体系是否合适。
 

空白对照：不含有任何组织/DNA的对照组，用来质控PCR体系是否发生污染。
 

内部阳性对照：引物通常扩增与目的基因无关的基因组DNA区域，用来判断PCR体系和模板质量是否合适。

 

2）引物设计：引物设计是PCR成功的关键。

设计引物时需要注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。如果引物设计不佳，可能会导致PCR产物少或没有目的条带。

 

3）污染控制：在实验过程中，要严格控制污染。样本采集时要避免交叉污染，DNA提取和PCR操作要在无菌环境下进行，使用一次性耗材和无核酸酶污染的试剂。

 

04、常见问题及解决方法

 

1）PCR产物少或没有目的条带
 

可能的原因包括：组织提取物中的污染物抑制了PCR反应、组织消化不够充分、引物设计不佳、待扩增片段GC含量偏高或长度较长等。
 

解决方法：检测抑制物、延长消化时间、优化引物设计、使用适合高GC含量或长片段扩增的试剂和条件。

 

2）出现非特异性条带
 

可能是因为退火温度不合适、引物二聚体或模板量过多。解决方法：优化退火温度、减少模板量。

 

3）条带弥散
 

可能是由于DNA模板降解或PCR反应条件不佳。
 

解决方法：优化DNA提取方法，避免DNA降解；调整PCR反应条件，如变性时间、退火温度等。

 

参考资料：

[1]https://mp.weixin.qq.com/s/6J0hPRiS6H6tIs1st2bFBw

[2]王廷华.PCR理论与技术（第三版）.科学出版社,2005.

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