判断一个品系需不需要冷冻保存，需要考量以下几个因素：
 

1. 不容易获得、购买或自己制作的小鼠品系。
 

2. 暂时用不到，但一年或更久后可能用得到。冷冻保存的期限现在已有的记录是40年左右。
 

3. 传代后现在表型非常稳定，有发展为稳定的疾病动物模型的可能。

 

方法

 

胚胎冷冻是将超排后的雌鼠与目的雄鼠交配后，取2细胞胚胎进行慢速冷冻并保存于-196℃液氮中。

 

1）优点：复苏后胚胎的成活率高（80%以上），且移植后的怀孕率及产仔率也较高。
 

2）缺点：胚胎冷冻的操作难度较大，需要专业的程序冷冻仪，且操作时间较长。

 

根据冷冻时的降温速率不同，胚胎冷冻方法主要分为慢速冷冻、快速冷冻和玻璃化冷冻。常用的小鼠冷冻方法是玻璃化冷冻。
 

 

1、过滤1M的DMSO溶液同时在培养皿中注入四个1M的DMSO液滴（100μL/液滴），其中一个液滴用于清洗收集液中的胚胎，其他的液滴则用于放置清洗后的胚胎。

 

2、将收集液中的一组胚胎移入其中的一个液滴内，然后将清洗后的胚胎均匀分配至另外三个液滴中，这些胚胎最终将被转移到冷冻管内。

 

3、取一20μL的移液器及凝胶枪头，调整移液量至5μL后吸取所有胚胎，移入冷冻管内，然后将冷冻管放入台式冷却器内在0℃状态平衡5分钟。
 

图源：小鼠生殖工程技术

 

注意:
 

1）尽可能将冷冻管放在0°C冷却器内可超过5分钟(<20分钟)。
 

2）吸取胚胎前，先将培养皿旋转几下使胚胎集中在液滴中央，以便于吸入5uL的1M的DMSO溶液中包含所有胚胎。

 

4、加入预先放置在0℃冷却器内平衡的抗冷冻液（DAP213）45μL，再平衡5分钟。

 

5、迅速将冷冻管卡入固定夹后直接浸入液氮中。

 

图源：小鼠生殖工程技术

 

 

1、从液氮罐中取出所需解冻的冷冻管，打开冷冻管盖子，废弃管内液氮，在室温下放置30秒钟。

 

2、用1mL微量移液器取预先加热至37℃的0.25M的蔗糖溶液0.9mL，吹打10来次后将管内溶液移入培养皿中。需注意的是，如果吹打过程中操作不当，会产生许多空气泡。将0.25M蔗糖（预热至37℃）加入冷冻管中，通过快速来回吸液加热样品。吹吸溶液时，要小心不要产生大量的气泡，也不要速度太快而非物理地破坏胚胎。一次性加热后，将冷冻管的内容物转移到塑料培养皿中。

 

图源：小鼠生殖工程技术

 

3、将0.4-0.5mL的0.25M的蔗糖放入冷冻管中，然后吸取内容物转移到塑料培养皿中，这样有助于稀释冷冻保护剂并确保所有的胚胎都能进行移植。
 

注意: 快速解冻可以避免冷冻保护液（DAP213）的毒性对胚胎可能造成的损伤。

 

4、从液滴中吸取胚胎并小心地转移到一滴KSOM/AA（清洗培养皿）中，然后置于培养箱（37℃，空气中含5%的CO2）中。
 

显微照片：玻璃化冷冻复苏后的胚胎

图源：小鼠生殖工程技术

 

5、10分钟后，用新鲜的KSOM/AA（清洗培养皿）清洗胚胎二次。

 

 

定义

 

精子冷冻是将雄鼠的精子通过快速冷冻保存于液氮中。
 

优点：操作速度快，精子保存量大，适合大规模保存小鼠品系。
 

 

1、颈椎脱臼处死一只适龄雄性小鼠，无菌条件下取出两个附睾尾。

 

2、将附睾尾部放在滤纸上，在显微镜下清除所有脂肪和血液。

 

3、将附睾尾部转移到冷冻保护剂中，用5#钟表钳固定后用微弹簧剪刀在附睾上剪5-6个切口。

 

4、将培养皿放在37度的热台上3分钟，期间，每分钟摇动一下培养皿，使精子从附睾中释放出来。

 

5、将麦管和注射器相连，先吸取100μl HTF，然后吸取15mm的空气，再吸取10μl精液和15mm空气。

 

图源：小鼠生殖工程技术

 

6、 用封口仪对麦管两端进行封口，管上标记小鼠相关信息。

 

7、把样品放入预冷罐并将其漂浮在低温生物容器的液氮表面。10分钟后，快速将预冷罐浸入液氮中。

 

图源：小鼠生殖工程技术

 

 

精子复苏是将冻存的精子从液氮中取出，放置于37度环境中10分钟后转入获能液中进行精子获能，获能后的精子通过体外受精的方式获得受精卵，再移植入假孕母鼠体内。
 

优点：可以一次性获得较多数量的小鼠，适合大规模繁殖。

 

 

 

1. 从复苏开始考虑，假如是胚胎冷冻，那么复苏后得到的后代就是当初冷冻的小鼠品系基因型。假如是精子冷冻，复苏时需要考虑卵子提供者，比如是B6，那么复苏后得到的后代都是至少和B6交配一代的杂合基因型。

 

2. 从冷冻的费用考虑：

1）胚胎冷冻在冷冻过程中花费大量时间，冷冻费用高，但复苏费用低。

 

2）精子冷冻则相反，冷冻费用低且耗时短，速度快，但复苏时采用体外受精（IVF）费用相对要高，但精子复苏可以一次性得到很多只后代。

 

 

1. 多基因纯合小鼠推荐胚胎冷冻。其获得需要历经长期的繁育筛选过程，胚胎冻存时可使用同品系的纯合雌雄鼠获得胚胎，复苏时可获得持有原有基因型的仔鼠。

 

2. 单基因小鼠和多基因杂合子小鼠推荐做精子冷冻。复苏时可使用野生型雌鼠或实验所需要的某种遗传工程雌鼠。

 

3. 很多时候需要具体情况具体对待。具体选择哪种，还取决于现有动物数量。

 

 

传统的动物模型技术包括原核显微注射技术和ES打靶嵌合技术，采用的是“小鼠造小鼠”模式，需要通过2-3代繁育过程获得纯合小鼠，整个过程至少耗时6-8个月乃至数年。

 

 

明迅生物自主研发的TurboMice™技术突破了小鼠造模周期长和复杂模型成功率低的技术难题，可实现几乎任何目标基因位点的编辑，从小鼠胚胎干细胞直接批量制备基因编辑目标小鼠，绕开常规技术耗时的繁育与筛选步骤，造模周期大大缩短，2-4个月内交付纯合子小鼠！

 

参考资料：

[1] https://www.larc.tsinghua.edu.cn/post/388/31

[2] https://labanimal.shanghaitech.edu.cn/cms/12079.html

[3] https://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/chinese/sigen/manual/spfreeze.html

[4] Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234.

 

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