基因敲除（Gene Knockout, KO）是指通过同源重组或核酸酶介导的DNA双链断裂修复机制，对生物体基因组中的特定基因进行定点删除、插入或替换，使其功能永久性丧失的一种基因编辑技术。

 

其中，同源重组介导的基因敲除是经典的实现方法之一。

 

该方法基于DNA同源重组机制，通过外源DNA与宿主基因组中目标区域的同源序列发生重组，实现目标基因的敲除或替换。其核心原理在于，当引入的外源DNA片段与基因组中的靶位点具有高度同源的序列时，细胞内的同源重组修复途径会被激活，促使外源DNA精确地替换掉原有的基因组片段，从而实现对目标基因的定向破坏或修饰。

图源iGEM

 

核心步骤包括：

 

①打靶载体设计与构建：设计与靶位点上下游高度同源的DNA片段（同源臂，通常1-2kb），中间插入正负筛选标记（如Neo⁺/TK⁻），经酶切线性化后制备转染质粒。

 

②ES细胞转染与同源重组：将线性化载体通过电穿孔等方法导入小鼠胚胎干细胞，利用细胞自身的同源重组修复机制，实现外源序列对靶基因的精准替换，从而破坏其功能。

 

③筛选与模型建立：通过药物筛选和分子鉴定（如Southern印迹、PCR）获得正确同源重组的ES克隆，经囊胚注射和胚胎移植获得小鼠。成功获得基因修饰小鼠后，需对后代进行基因型鉴定。

 

该方法的优势在于其高度的精确性与可预测性，能够实现大片段的基因删除，且建立的模型遗传背景稳定、修饰可遗传，是进行长期、系统性生物学研究的基石。

 

基因型分析

 

在动物模型中进行基因敲除验证时，通常可获得杂合与纯合两种基因型。

 

杂合子（Heterozygote）：指两个等位基因中仅有一个发生了目标移码突变，而另一个等位基因保持野生型序列的个体。在此情况下，野生型等位基因仍可编码具有一定功能的蛋白质产物，因此整体基因功能通常未被完全破坏，仅表现为部分功能降低或显性负效应，具体取决于基因的剂量敏感性及蛋白功能特性。

 

其中，功能完全丧失的纯合敲除表型主要包含以下两种类型：

 

纯合子（Homozygote, HO）：指两个等位基因均携带相同的移码突变（如均发生4 bp缺失），其基因组背景高度一致，遗传组成均一。该类型因突变位点与形式完全一致，在功能比较和实验数据标准化分析中具有明显优势，是理想的研究材料。

 

复合杂合子（Compound Heterozygote）：指两个等位基因均发生移码突变，但突变形式不同（如一个为1 bp缺失，另一个为5 bp缺失）。尽管突变序列存在差异，但两者均导致阅读框移位并引发翻译提前终止，因而在功能上等同于纯合子，即实现目标基因功能的完全丧失。该类型在相关研究中亦被广泛认可。

 

综上，上述两种基因型均表现为双等位基因的移码突变，且在功能水平上等效，其主要差异在于所携带的突变序列是否一致。

 

技术应用

 

基因敲除是连接基因序列与生物功能的桥梁，其应用深刻影响着现代生命科学与医学研究：

 

1）基因功能研究：直接揭示基因在发育、代谢等生命过程中的作用。

 

2）疾病解密：通过敲除特定基因，构建高度模拟人类疾病的模型（如癌症、遗传病），是研究发病机制的利器。

 

3）药物研发的“试金石”：在验证一个新药靶点时，最直接的证据就是敲除该靶点基因后，疾病表型能否被逆转或改善。它是将靶点假设转化为切实疗法的关键一步。

 

明迅生物基因敲除

 

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