在小鼠模型构建中，获得稳定整合并表达外源基因的阳性细胞克隆是关键步骤。其中新霉素抗性（NeoR）和嘌呤霉素抗性（PuroR）筛选最为常用。

 

其核心原理是将目的基因与抗性基因共转染至宿主细胞（如胚胎干细胞ES细胞），随后在含相应抗生素的培养基中培养，通过抗生素的持续压力，淘汰未能将抗性基因稳定整合入基因组并有效表达的细胞，最终富集出稳定转染的阳性克隆。

 

新霉素抗性 (NeoR)筛选

 

新霉素抗性筛选依赖于氨基糖苷类抗生素G-418（Geneticin）。G-418主要通过不可逆地结合核糖体，抑制蛋白质延伸，从而阻断蛋白质合成，对原核和真核细胞均有广泛毒性。neoR基因（源于转座子Tn5）编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH(3‘)II），该酶可对G418进行共价修饰，抑制抗生素-核糖体间的相互作用，从而使得抗生素失活，赋予细胞抗性。

 

特点：作用较慢，筛选周期通常需10至14天，是构建基因编辑小鼠时筛选胚胎干细胞（ES细胞）的经典选择。

 

浓度：工作浓度范围较宽（200-1000μg/mL）。由于不同细胞系对 G418 的敏感性差异很大，筛选前必须通过“杀灭曲线”实验确定最佳筛选浓度。

 

实验步骤

 

①确定最佳筛选浓度（杀灭曲线实验）：

 

将对数生长期的未转染细胞，以约30%的密度接种于 24 孔板。

 

设置G-418浓度梯度（例如：0, 200, 400, 600, 800, 1000μg/mL）。

 

每 2-3 天更换一次含相应浓度G-418的新鲜完全培养基。

 

培养7-10天后，显微镜下观察。能在此时间内导致所有细胞死亡的最低浓度，即为该细胞系的最佳筛选浓度。（通常为400–800μg/mL）

 

②稳定转染株筛选：

 

转染24-48小时后，将细胞以较低密度（如1:10至1:20）传代至含最佳筛选浓度G-418的培养基中。

 

每2-3天更换含药培养基，维持筛选压力。

 

持续筛选10-14天，直至阴性对照孔细胞完全死亡，可见明显的抗性克隆。

 

使用克隆环或有限稀释法挑取单克隆，扩大培养用于后续鉴定。

 

 

嘌呤霉素抗性(PuroR)筛选

 

嘌呤霉素抗性筛选利用抗生素嘌呤霉素。嘌呤霉素是一种氨基核苷类抗生素，化学结构与tRNA分子末端类似，能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同核糖体的 A 位点结合，并掺入到生长的肽链中。

 

其作用机制是模拟氨酰化tRNA的 3‘末端，在翻译过程中掺入新生肽链，导致翻译提前终止，从而抑制蛋白质合成。puroR基因（即pac基因）编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），通过乙酰化修饰使嘌呤霉素失活，赋予细胞抗性。

 

特点：作用迅速，可在24-72小时内有效杀死非抗性细胞，筛选周期较短，通常为5-7天，特别适用于需要快速富集转染成功细胞的实验。

 

浓度：有效浓度范围较低（1-10μg/mL），嘌呤霉素在培养基中会被细胞代谢降解，通常需要每日或隔日更换含药培养基以维持有效压力。

 

实验步骤

 

①确定最佳筛选浓度：

 

将未转染细胞以约20-30%密度接种于96孔板。

 

设置嘌呤霉素浓度梯度（例如：0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL）。

 

培养48-72小时后观察，确定能完全杀死细胞的最低浓度。（通常为2~5μg/mL）；

 

②稳定转染株筛选：

 

1.转染24小时后，更换为含最佳筛选浓度嘌呤霉素的培养基。

 

2.每日观察，阴性对照细胞应在72小时内大量死亡。

 

3.筛选5-7天后，存活的细胞团即为阳性克隆。可根据实验目的进行混合培养或分离单克隆。

 

在实际应用中，两种系统各具特点。新霉素抗性筛选过程相对温和，适用于对药物较敏感的细胞系（如ES细胞），是构建稳定细胞株和小鼠模型的经典选择。嘌呤霉素抗性筛选优势在于快速、高效。

 

抗性筛选选择需综合考虑细胞类型、外源载体携带的抗性基因以及实验周期。无论选择哪种，进行预实验以确定特定细胞系的最佳筛选浓度是确保成功的关键步骤。

 

 

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