胚胎冷冻是将超排后的雌鼠与目的雄鼠交配后，取2细胞胚胎进行慢速冷冻并保存于-196℃液氮中。如何选择可从复苏和费用两方面考虑，下面一起来探讨。

 

胚胎冷冻

 

方法

 

胚胎冷冻是将超排后的雌鼠与目的雄鼠交配后，取2细胞胚胎进行慢速冷冻并保存于-196℃液氮中。

 

1）优点：方法普通可靠、品系基因全部保留、纯合子胚胎可以冷冻、复苏方法简单。复苏后胚胎的成活率高（80%以上），且移植后的怀孕率及产仔率也较高。
 

2）缺点：胚胎冷冻的操作难度较大，需要专业的程序冷冻仪，且操作时间较长。

 

根据冷冻时的降温速率不同，胚胎冷冻方法主要分为慢速冷冻、快速冷冻和玻璃化冷冻。常用的小鼠冷冻方法是玻璃化冷冻。
 

玻璃化冷冻原理

 

胚胎内的水分高达80%以上，冷冻过程中产生的冰晶是胚胎冷冻的最大障碍。

 

玻璃化冷冻是一种超快速冷冻技术，它利用高浓度冷冻保护剂，在极快速降温过程中，使胚胎周围的冷冻保护剂溶液转变为一种高粘度的玻璃样非晶体固体状态。

 

在玻璃化状态下，细胞内的分子和离子分布得以保持，避免了传统慢速冷冻过程中冰晶形成对细胞造成的损伤，从而提高了胚胎的存活率。

 

冷冻保护剂种类

 

冷冻保护剂的种类和降温速度的控制是胚胎冷冻保存中克服冰晶形成的关键要素。

 

冷冻保护剂是胚胎冷冻技术中的关键物质，主要分为以下几类：
 

渗透性冷冻保护剂：如乙二醇（EG）、二甲基亚砜（DMSO）等。可渗入细胞内替代水分，防止细胞内冰晶形成，但对细胞有一定毒性。
 

非渗透性冷冻保护剂：如蔗糖、聚蔗糖等。不能自由透过细胞膜，通过提高细胞外液渗透压，促使细胞脱水，减少解冻复温时的渗透休克。
 

生物活性类物质：如牛血清白蛋白等。能稳定细胞膜结构，防止透明带在冷冻过程中硬化，降低渗透压变化对胚胎的影响。

 

玻璃化冷冻操作步骤

 

1、过滤1M的DMSO溶液同时在培养皿中注入四个1M的DMSO液滴（100μL/液滴），其中一个液滴用于清洗收集液中的胚胎，其他的液滴则用于放置清洗后的胚胎。

 

2、将收集液中的一组胚胎移入其中的一个液滴内，然后将清洗后的胚胎均匀分配至另外三个液滴中，这些胚胎最终将被转移到冷冻管内。

 

3、取一20μL的移液器及凝胶枪头，调整移液量至5μL后吸取所有胚胎，移入冷冻管内，然后将冷冻管放入台式冷却器内在0℃状态平衡5分钟。
 

 

图源：小鼠生殖工程技术

注意:
 

1）尽可能将冷冻管放在0°C冷却器内可超过5分钟(<20分钟)。
 

2）吸取胚胎前，先将培养皿旋转几下使胚胎集中在液滴中央，以便于吸入5uL的1M的DMSO溶液中包含所有胚胎。

 

4、加入预先放置在0℃冷却器内平衡的抗冷冻液（DAP213）45μL，再平衡5分钟。

 

5、迅速将冷冻管卡入固定夹后直接浸入液氮中。

 

图源：小鼠生殖工程技术

 

选择胚胎冷冻，还是精子冷冻？

 

1. 从复苏开始考虑，假如是胚胎冷冻，那么复苏后得到的后代就是当初冷冻的小鼠品系基因型。假如是精子冷冻，复苏时需要考虑卵子提供者，比如是B6，那么复苏后得到的后代都是至少和B6交配一代的杂合基因型。

 

2. 从冷冻的费用考虑：

1）胚胎冷冻在冷冻过程中花费大量时间，冷冻费用高，但复苏费用低。

 

2）精子冷冻则相反，冷冻费用低且耗时短，速度快，但复苏时采用体外受精（IVF）费用相对要高，但精子复苏可以一次性得到很多只后代。

 

推荐做哪种保存呢？

 

1. 多基因纯合小鼠推荐胚胎冷冻。其获得需要历经长期的繁育筛选过程，胚胎冻存时可使用同品系的纯合雌雄鼠获得胚胎，复苏时可获得持有原有基因型的仔鼠。

 

2. 单基因小鼠和多基因杂合子小鼠推荐做精子冷冻。复苏时可使用野生型雌鼠或实验所需要的某种遗传工程雌鼠。

 

3. 很多时候需要具体情况具体对待。具体选择哪种，还取决于现有动物数量。

 

明迅生物四倍体补偿技术

 

传统的动物模型技术包括原核显微注射技术和ES打靶嵌合技术，采用的是“小鼠造小鼠”模式，需要通过2-3代繁育过程获得纯合小鼠，整个过程至少耗时6-8个月乃至数年。

 

明迅生物自主研发的TurboMice™技术突破了小鼠造模周期长和复杂模型成功率低的技术难题，可实现几乎任何目标基因位点的编辑，从小鼠胚胎干细胞直接批量制备基因编辑目标小鼠，绕开常规技术耗时的繁育与筛选步骤，造模周期大大缩短，2-4个月内交付纯合子小鼠，欢迎各位老师咨询！

 

参考资料：

[1] https://www.larc.tsinghua.edu.cn/post/388/31

[2] https://labanimal.shanghaitech.edu.cn/cms/12079.html

[3] Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234.

 

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