在基因编辑小鼠模型构建中，质粒是最核心的递送载体。它不仅是将编辑工具送入细胞的递送工具，更是决定编辑效率与稳定性的关键。本文将从小鼠模型构建的实际需求出发，为您系统拆解质粒的设计逻辑、必备元件。

 

 

什么是质粒？

 

质粒是独立于染色体外的双链环状 DNA，能在宿主细胞（如大肠杆菌、ES 细胞）中自主复制。在基因编辑中，它承担着两大核心任务：

 

体外扩增与储存：利用细菌系统（如大肠杆菌）快速复制，获得高纯度DNA。

 

细胞内递送与表达：转染进ES细胞或受精卵后，驱动编辑工具表达，完成敲除、敲入或点突变。

 

 

质粒的主要种类

 

质粒按宿主类型可分为原核载体、真核载体、病毒载体；按功能可分为克隆载体、表达载体、穿梭载体、报告基因载体等。不同种类的质粒，其核心结构元件会根据“功能需求”和“宿主适配性”进行设计。

 

 

 

质粒核心结构元件

 

基因编辑小鼠模型构建中，质粒核心结构元件需整合两类关键模块：哺乳动物表达元件（如CMV启动子、Kozak序列、polyA信号）和细菌复制/筛选元件（如pUC ori、氨苄抗性），便于体外扩增和测序验证。

 

 

1、复制起始点Origin of Replication(Ori)：质粒DNA开始复制的位置，主要功能是控制质粒的复制起始。pUC ori是高拷贝复制起点，能让质粒在大肠杆菌中快速扩增，便于大量抽提。若需在 ES 细胞中建立稳定细胞系，需包含 SV40 ori，配合SV40大T抗原实现高拷贝维持。

 

核心特点如下：

 

1）序列结构：Ori 区域具有高A-T含量，其较低的氢键稳定性有利于DNA解链，从而启动复制。

 

2）复制调控：Ori 的类型（如pUC、ColE1、pSC101）是决定质粒拷贝数的主要因素，进而影响其扩增效率。

 

3）宿主特异性：质粒的宿主范围由Ori序列与宿主复制蛋白（如大肠杆菌DnaA）的识别兼容性决定，分为窄宿主型与广宿主型。

 

4）不相容性：携带相同或高度同源Ori的质粒属于同一不相容群，它们在细胞内竞争复制资源，导致无法稳定共存。

5）复制机制：Ori 是双向复制（θ型）的起始点。原核质粒通常为单一起点，而真核染色体则具有多个复制起点。

 

2、筛选标记：质粒上一段赋予宿主细胞抗生素抗性的特定基因序列。通过在含抗生素的培养基中培养，可高效识别并筛选出成功转入目标质粒的细胞。

 

筛选标记分为“细菌筛选”和“真核筛选”：

 

一）原核筛选

 

氨苄青霉素抗性基因(Ampicillin ，AmpR)：基因编码 β-内酰胺酶，水解氨苄青霉素。用于筛选含质粒的大肠杆菌菌落。

 

卡那霉素抗性基因(Kanamycin，KanR)：编码氨基糖苷磷酸转移酶，灭活卡那霉素。

 

二）真核筛选

 

新霉素抗性基因(Neomycin ，NeoR)：抗 G418。最常用于 ES 细胞或小鼠成纤维细胞的稳定筛选，建立基因编辑后的稳转株。

 

嘌呤霉素抗性基因(Puromycin，PuroR)：抗嘌呤霉素。作用快，常用于快速富集转染成功的细胞。

 

潮霉素β抗性基因(Hygromycin，HygR)：抗潮霉素。常作为第二筛选标记，用于多质粒共转染区分。

 

3、多克隆位点 (MCS)：包含多个限制性内切酶的识别位点,使得外源DNA片段能够通过酶切和连接的方式插入到载体中。当外源基因被成功插入多克隆位点后，该基因将被启动子驱动转录，并在宿主细胞内合成目标蛋白质。

 

基因编辑特需元件

 

1）启动子可分为两类：组成型启动子和诱导型启动子。对于需要强、广泛表达的编辑工具，选择强组成型启动子（如CMV、CAG）；对于需要在特定细胞类型中稳定、长期表达，或需要精准时空调控的情况，则选用细胞类型特异性或诱导型启动子。

 

CMV 启动子：人巨细胞病毒立即早期启动子。强启动子之一，广泛用于驱动 Cas9 蛋白的高效表达，适合瞬时转染获得高编辑效率。

 

CAG 启动子：在绝大多数哺乳动物细胞中均表现出极强的转录活性，且较CMV更不易发生表观沉默，是驱动基因高强度、广谱表达的优选启动子。

 

EF1α 启动子：人延伸因子 1α 启动子。在ES细胞、干细胞中表现更稳定，不易发生表观沉默，适合长期稳定表达。

 

2） 翻译与加工优化元件

 

Kozak 序列：位于起始密码子（ATG）周围，优化核糖体结合，提升 Cas9 蛋白的翻译效率。

 

内含子：如 EF1α 的第一内含子。研究表明内含子的存在能显著提升 mRNA 的稳定性与核输出，从而提升基因表达水平。

 

多腺苷酸化信号Poly(A) 信号：大多数真核新生mRNA在其3′端具有poly（A）尾，如 bGH pA（牛生长激素 polyA）或 SV40 pA。确保 mRNA 正确加尾，防止降解，是表达载体的必备元件。

 

3） 同源臂与修复模板 (HR donor)

 

对于基因敲入（Knock-in）或条件性敲除（cKO）模型，质粒中需包含 500-1000 bp 的同源臂，位于编辑位点两侧，用于引导细胞进行同源重组修复（HDR），而非易错的 NHEJ 修复。

 

参考资料：

[1]Makrides SC. Vectors for gene expression in mammalian cells. New Comprehensive Biochemistry. 2003;38:9–26. doi: 10.1016/S0167-7306(03)38002-0. Epub 2004 Jan 7. PMCID: PMC7147855.

 

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