在生物学研究中，实现单载体多基因共表达或目的基因细胞谱系示踪常面临技术路径的选择：内部核糖体进入位点（IRES）与2A自剪切肽（如P2A）。

 

这两种策略均能在单一启动子驱动下实现多顺反子表达，但其分子机制、表达效率及应用场景存在显著差异。

 

IRES：基于翻译起始的独立通路

 

1）分子机制：真核生物的标准翻译起始高度依赖mRNA的5'端帽子（Cap）结构。而IRES作为一种结构复杂的RNA元件（通常源自病毒，如EMCV），能够绕过帽子结构，直接在mRNA内部招募核糖体启动翻译。在双顺反子载体中，上游基因（Gene A）利用5'帽子启动翻译，下游基因（Gene B）则依赖IRES元件独立启动翻译。

 

2）优势与局限：IRES不干扰基因的阅读框，IRES上下游的两个蛋白可以同时表达，并且基因翻译出的蛋白是完全独立的，上游蛋白C端和下游蛋白N端均无任何外源氨基酸残留。所以它非常适合用于结构生物学研究或对末端修饰极其敏感的蛋白（如某些分泌因子或酶）。

 

IRES局限主要在于：

 

1. 载体容量压力：IRES序列长度通常超过 500 bp，在构建多基因（三顺反子及以上）载体或使用容量受限的病毒载体（如AAV）时，会显著增加构建难度并影响包装效率。

 

2. 表达量不对称：帽子依赖的翻译效率远高于IRES介导的内部起始。下游蛋白（Gene B）的表达量通常仅为上游蛋白（Gene A）的 10%–50%。这导致其在需要高亮度荧光示踪或等量表达调控元件的实验中表现不佳。

 

2A自剪切肽：基于核糖体“跳跃”的共翻译切割

 

1）分子机制

 

2A肽是一类来源于病毒的短肽序列（约18-22个氨基酸）。其核心机制并非真正的酶切，而是核糖体在翻译过程中遇到2A肽的特定结构（GDVEXNPGP）时发生“跳跃”，导致肽链在C端的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之间发生断裂。这会导致上游蛋白C端会留下约20个氨基酸的2A残基，下游蛋白N端会多出一个脯氨酸（P）。

图源2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori

 

目前常用的有4种2A肽：F2A（口蹄疫病毒），E2A（马鼻炎A病毒），P2A（ 猪圆环病毒1），T2A（TaV）。P2A通常表现出最高的切割效率（接近100%），其次是T2A、E2A，而F2A效率较低（约50%）

 

图源High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice

 

2）优势与局限

 

优势：

 

等量表达：由于是同一mRNA链上的连续翻译，上下游蛋白的表达水平高度一致，适合需要等量共表达的场景（如CAR-T结构中的scFv与信号域）

 

尺寸小：2A序列仅约 60 bp，极大地缓解了载体容量压力，便于构建三基因甚至四基因的串联载体。

 

2A肽主要局限在于末端残留问题，上游蛋白C端会残留约20个氨基酸的2A肽段，下游蛋白N端则会多出一个外源的脯氨酸。这些末端残留可能干扰蛋白的正确折叠、定位（如分泌、膜锚定）或功能，对小分子多肽或功能结构域紧邻末端的蛋白影响尤为显著，使用时必须通过实验验证。

 

如何选择IRES和2A肽？

 

基于上述特性，二者的选择可以参考以下逻辑：

 

IRES：适用于驱动非关键的辅助蛋白。当对下游蛋白纯度要求极高（必须无残基），且对表达量要求不高时，IRES是首选。经典应用是驱动药物筛选标记（如嘌呤霉素抗性基因）或报告基因，其微量表达即可工作，且功能不受低表达量影响。

 

2A肽：适用于关键功能蛋白必须高表达且比例精确，或载体容量受限的共表达系统。经典应用包括多亚基复合体、CAR-T结构、多基因回路的构建，推荐使用P2A或T2A。

 

多基因串联：对于三基因、四基因的连接，连接元件组合使用频率通常为：2A/2A >2A/IRES> IRES/IRES。为避免同源重组。建议使用不同种类的2A肽（如P2A和T2A联用）进行间隔。

 

 

参考资料：

[1]Wang Y, Wang F, Wang R, Zhao P, Xia Q. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Sci Rep. 2015 Nov 5;5:16273. doi: 10.1038/srep16273. PMID: 26537835; PMCID: PMC4633692.

[2]Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, Lee KY, Kim MK, Shin BA, Choi SY. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 2011;6(4):e18556. doi: 10.1371/journal.pone.0018556. Epub 2011 Apr 29. PMID: 21602908; PMCID: PMC3084703.

 

特别声明：本文来自明迅生物公众号，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在公众号后台留言联系我们。其他合作需求，请联系sales@mingceler.com。

免责声明：部分素材源于网络，如有侵权，联系删除，本文仅作信息交流之目的，亦不是提供治疗方案，文中观点不代表明迅生物立场，亦不代表明迅生物支持或反对文中观点。